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快速掌握三代測序有哪些我們不能忽視的質(zhì)控點
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作者:201321492800086
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發(fā)布時間: 1809天前
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測序技術(shù)經(jīng)過第一代、第二代的發(fā)展，讀長從一代測序的近1000bp，降到了二代測序的幾百bp，通量和速度大幅提升，而第三代測序的發(fā)展思路在于保持二代測序的速度和通量優(yōu)勢的同時，彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比，最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。
測序技術(shù)經(jīng)過第一代、第二代的發(fā)展，讀長從一代測序的近1000bp，降到了二代測序的幾百bp，通量和速度大幅提升，而第三代測序的發(fā)展思路在于保持二代測序的速度和通量優(yōu)勢的同時，彌補其讀長較短的劣勢。三代測序與前兩代相比，最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。
那么三代測序當(dāng)中會有哪些質(zhì)控點呢?下面我們以PacBio為例為大家作以簡單敘述：
與二代測序一樣，PacBio三代測序的第一步也是核酸提取，其次是建庫，其最主要的區(qū)別是建庫過程中不涉及PCR反應(yīng)。DNA分子打斷之后，經(jīng)過修復(fù)、接頭連接、純化和聚合酶綁定，即可出庫準備上機測序。
質(zhì)控點一：基因組DNA或Total RNA
目前市場上的核酸提取大部分都是靠儀器去完成的，當(dāng)然樣本量少的情況下我們也會手動提取，因樣本或提取試劑盒差異或多或少都會出現(xiàn)提取失敗的情況，有時候也會因保存不當(dāng)發(fā)生樣本降解的情況，這時候就需要對提取后核酸進行質(zhì)控了。
傳統(tǒng)的質(zhì)控方法是先對樣本進行定量，濃度合格后再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，很是費時費力。全新的毛細管電泳技術(shù)是一種以毛細管為分離通道、高壓直流電場為驅(qū)動力的新型核酸分離技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳而言，具有高效、快速、成本低、應(yīng)用模式開放等顯著優(yōu)勢，目前已在分子生物學(xué)領(lǐng)域迅速推廣開來。小編今天為大家介紹的就是這樣一款Qsep全自動毛細管電泳儀（圖1），無需配膠加染料，無需進行凝膠成像，輕輕松松就可獲得想要的結(jié)果。
以下圖例為Qsep全自動毛細管電泳儀檢測的實驗結(jié)果圖。對基因組DNA（圖2）來說，它可以直觀的看到片段大小及降解程度，并提供DQN值（1-10分）對基因組DNA進行完整性評估；對Total RNA（圖3）來說，除了直觀呈現(xiàn)18s和28s峰型分布和占比之外，同樣也會有標準化評估的RQN值（1-10分），分值越高代表完整性越好。
例1：在基因組測序文庫構(gòu)建過程中，要先將基因組DNA打斷破碎成大片段（通常是20kb左右），之后經(jīng)過末端修復(fù)、接頭連接、片段篩選、雜交測序引物和DNA聚合酶綁定（圖 4）等步驟，我們的SMRT Bell DNA文庫就制備成功了。那打斷后的DNA及片段篩選后的文庫（圖5）是否是我們想要的大小呢，會不會有小片段殘留，都可以通過Qsep全自動毛細管電泳儀來進行質(zhì)控，它目前可以測到的最大片段為165k（圖6）。整個文庫構(gòu)建過程沒有經(jīng)過PCR，這也是三代基因組測序文庫構(gòu)建的最大亮點！
例2：在全長轉(zhuǎn)錄組測序文庫構(gòu)建中，也可以用Qsep全自動毛細管電泳儀來進行質(zhì)控，它的文庫制備要相對較為復(fù)雜那么一點。首先，我們需要從總RNA中篩選獲得polyA(+)RNA，之后利用SMARTerTMPCR cDNA Synthesis Kit進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA合成后需要使用KAPA HiFi PCR Kit進行PCR擴增，擴增后按片段大小對cDNA進行分選，為保證獲得足夠量的cDNA進行后續(xù)建庫測序，分選后cDNA片段經(jīng)過PCR再次擴增，之后經(jīng)過末端修復(fù)、接頭連接、片段篩選、雜交測序引物和DNA聚合酶綁定就可以上機測序了（圖7）。
與二代測序的堿基質(zhì)量標準Q20/Q30不同，三代測序由于其隨機分布的堿基錯誤率，其單堿基的準確性不能直接用于衡量數(shù)據(jù)質(zhì)量。那么，怎么判斷三代測序的數(shù)據(jù)好不好呢？
在上游實驗環(huán)節(jié)，最關(guān)鍵的影響因素是文庫的構(gòu)建。高質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度長，質(zhì)量好；而低質(zhì)量的文庫產(chǎn)出的數(shù)據(jù)長度短，質(zhì)量差。其次，就是看比例，需要關(guān)注有兩個比例：一個是subreads與polymerase reads數(shù)據(jù)量的比例，比例過低反映測序過程中的低質(zhì)量的序列較多；一個是zmw孔載入比例，根據(jù)孔中載入的DNA片段數(shù)分為P0、P1和P2，P1合理比例在40%-60%之間，上樣濃度異常會導(dǎo)致P0或P2比例過高，有效數(shù)據(jù)量減少。不管是二代還是三代測序，想要下機數(shù)據(jù)好，前期的步步質(zhì)控是關(guān)鍵。
