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核酸電泳新選擇——全自動快速分析核酸
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作者:201321492800086
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發(fā)布時間: 1938天前
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核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，而電泳的質(zhì)量直接決定了后續(xù)實驗的成敗，實驗室常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。
核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段，而電泳的質(zhì)量直接決定了后續(xù)實驗的成敗，實驗室常用的有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。
瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法以瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠作為支持物。瓊脂糖凝膠是一種聚合鏈線性分子含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構(gòu)成的分子篩的網(wǎng)孔大小不同，適于分離不同濃度范圍的核酸分子。聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺在在催化物催化條件下聚合形成長鏈，并通過亞甲雙丙烯酰胺交叉連接形成網(wǎng)孔，網(wǎng)孔的大小由丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺的相對比例決定。電泳就是利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以核酸分子帶正電，在電場中向負極泳動；而pH8.0-9.3時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負電，在電場中向正極泳動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此凈電荷對泳動速度影響不大，使得它們能以同樣的速率向正極方向移動。
在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同，如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子（ocDNA）、和線形DNA分子（IDNA）。這三種不同構(gòu)型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為：cccDNA＞IDNA＞ocDNA。
瓊脂糖凝膠適合分離長度100bp至20kb的分子，聚丙烯酰胺凝膠對于小片段（5bp-500bp）的分離效果最好。
瓊脂糖凝膠形成過程
瓊脂糖凝膠
丙烯酰胺分子式
N,N’-亞甲雙丙烯酰胺
聚丙烯酰胺網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)
聚丙烯酰胺凝膠
影響核酸分子泳動率的因素主要有：
1、樣品的物理性狀
即分子的大小、電荷數(shù)、顆粒形狀和空間構(gòu)型。一般而言，電荷密度越大，泳動率越大。但是不同核酸分子的電荷密度大致相同，所以對泳動率的影響不明顯。
對線形分子來說，分子量的常用對數(shù)與泳動率成反比，用此標準樣品電泳并測定其涌動率，然后進行DNA分子長度（bp）的負對數(shù)——泳動距離作標準曲線圖，可以用于測定未知分子的長度大小。
DNA分子的空間構(gòu)型對泳動率的影響很大，比如質(zhì)粒分子，泳動率的大小順序為：cDNA＞IDNA＞ocDNA。
2、電場強度
電場強度越大，帶電離子的泳動越快，但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時一般采用低電壓，對于大片段分子的話，則需要更小的電壓。
3、緩沖液離子強度
緩沖液pH常偏堿性或中性，此時核酸分子帶負電，向正極移動。電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低時，pH會偏大，緩沖能力減弱，會影響電泳效果。
相信很多實驗人員平時跑電泳的時候會遇到很多問題，配膠步驟繁瑣、染料有毒、分辨率低、電壓選擇不當?shù)榷紩O大的降低我們的工作效率。隨著科技的發(fā)展，其實我們還有其它選擇，那就是毛細管電泳儀，近期中國臺灣Bioptic公司推出了一款便攜式毛細管電泳儀——Qsep1 lite，這款儀器輕巧、簡便、易操作；采用預制膠卡夾、即插即用、安全無毒；檢測快速，最快可達到1分鐘內(nèi)/樣本；靈敏度可達到pg級別，樣品消耗只需1微升?？捎糜?/span>PCR產(chǎn)物分析、物種遺傳多樣性檢測、核酸質(zhì)檢、質(zhì)粒DNA酶切構(gòu)造及純度分析、文庫質(zhì)控、RNA質(zhì)控等多種實驗。
Qsep1 lite
毛細管電泳原理示意圖
PCR產(chǎn)物分析對比圖
RNA質(zhì)控
酶切產(chǎn)物
