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做測序的你，不知道這個技術(shù)就可惜了
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作者:201321492800086
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發(fā)布時間: 1680天前
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隨著第二代測序(Next Generation Sequencing，NGS) 技術(shù)和第三代測序( Third Generation Sequencing，TGS)技術(shù)的快速發(fā)展，生物研究領(lǐng)域發(fā)生了巨大變革。然而，傳統(tǒng)的二代測序是從大量細(xì)胞中獲取足夠多的DNA或RNA，因此測序結(jié)果是這些細(xì)胞整體的表征，而不是單個細(xì)胞的具體情況。以我們熟悉的轉(zhuǎn)錄組測序為例，轉(zhuǎn)錄組測序是提取組織、器官或一群細(xì)胞的混合RNA進(jìn)行測序，得到的是一群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的平均數(shù)據(jù)，或者說是有代表性的數(shù)據(jù)，而細(xì)胞群體中單個細(xì)胞的特異性信息往往被掩蓋，很多低豐度的信息會在整體表征中丟失。再例如腫瘤中心的細(xì)胞，腫塊邊緣的細(xì)胞和腫塊周圍的細(xì)胞，乃至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息是存在一定差異的，而傳統(tǒng)的研究手段通常將整個腫瘤組織進(jìn)行研究，或者將腫瘤組織簡單分區(qū)分割，得到每一部分細(xì)胞基因表達(dá)的平均值，丟失了每個細(xì)胞的異質(zhì)性信息，使得對腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)及免疫功能的理解始終停留在組織層面。為了彌補傳統(tǒng)高通量測序的局限性，單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)運而生。
隨著第二代測序(Next Generation Sequencing，NGS) 技術(shù)和第三代測序( Third Generation Sequencing，TGS)技術(shù)的快速發(fā)展，生物研究領(lǐng)域發(fā)生了巨大變革。然而，傳統(tǒng)的二代測序是從大量細(xì)胞中獲取足夠多的DNA或RNA，因此測序結(jié)果是這些細(xì)胞整體的表征，而不是單個細(xì)胞的具體情況。以我們熟悉的轉(zhuǎn)錄組測序為例，轉(zhuǎn)錄組測序是提取組織、器官或一群細(xì)胞的混合RNA進(jìn)行測序，得到的是一群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組的平均數(shù)據(jù)，或者說是有代表性的數(shù)據(jù)，而細(xì)胞群體中單個細(xì)胞的特異性信息往往被掩蓋，很多低豐度的信息會在整體表征中丟失。再例如腫瘤中心的細(xì)胞，腫塊邊緣的細(xì)胞和腫塊周圍的細(xì)胞，乃至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息是存在一定差異的，而傳統(tǒng)的研究手段通常將整個腫瘤組織進(jìn)行研究，或者將腫瘤組織簡單分區(qū)分割，得到每一部分細(xì)胞基因表達(dá)的平均值，丟失了每個細(xì)胞的異質(zhì)性信息，使得對腫瘤微環(huán)境中各種細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)及免疫功能的理解始終停留在組織層面。為了彌補傳統(tǒng)高通量測序的局限性，單細(xì)胞測序技術(shù)應(yīng)運而生。
圖1. 2017年Nature和Science單細(xì)胞?？?/span>
單細(xì)胞測序技術(shù)是指在單個細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測序分析的一項新技術(shù)。它能夠揭示單個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，擁有高通量地對單細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析的特點，應(yīng)用方向也相當(dāng)廣泛。在科研領(lǐng)域，單細(xì)胞測序可以對人體各種細(xì)胞進(jìn)行測序，獲得人體單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序圖譜，并基于基因表達(dá)將細(xì)胞分類，定義新的細(xì)胞，繪制所有細(xì)胞及其分子的空間組織方式，而目前多項人類細(xì)胞圖譜工程也已經(jīng)在轟轟烈烈的進(jìn)行中；單細(xì)胞測序可以通過剖析細(xì)胞異質(zhì)性，鑒定不同細(xì)胞表型，進(jìn)一步結(jié)合擬時間曲線等手段探索細(xì)胞發(fā)育和分化路徑，在解析干細(xì)胞發(fā)育和分化機理等過程中發(fā)揮重要作用。
在臨床方面，單細(xì)胞測序可以應(yīng)用于體外受精的胚胎測序：在把胚胎植回母體之前，先取一個細(xì)胞進(jìn)行測序，確認(rèn)基因正常后再植回，以保證胚胎是正常的；CTC細(xì)胞測序：癌癥的血液檢測，通過對血液中的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行測序，找到突變位點，針對性能進(jìn)行靶向藥物治療；免疫細(xì)胞測序：免疫細(xì)胞在對抗原發(fā)生識別后，免疫細(xì)胞的基因組發(fā)生重排，并產(chǎn)生對抗原特異的抗體，對免疫細(xì)胞的測序，可以找出特異的基因結(jié)構(gòu)?？梢哉f，幾乎所有涉及細(xì)胞的領(lǐng)域都可以應(yīng)用單細(xì)胞測序，單細(xì)胞測序已經(jīng)成為神經(jīng)系統(tǒng)、發(fā)育、免疫研究、腫瘤等研究領(lǐng)域的強大的研究助攻！
單細(xì)胞測序能夠獲取每個單個細(xì)胞的遺傳信息，檢出混雜樣品中的異質(zhì)性細(xì)胞。目前主要有兩種策略來實現(xiàn)單細(xì)胞測序：1.將單個細(xì)胞分離出來，并獨立構(gòu)建測序文庫，最終進(jìn)行測序的路線，具體方法有有限稀釋法，流式分選法，激光切割法，顯微操作法，微流分離法等。這種策略的優(yōu)點是精確，節(jié)省細(xì)胞，缺點是單個細(xì)胞的操作成本比較高，隨著測序細(xì)胞數(shù)增加，所需要的費用將直線上升。2.基于標(biāo)簽（barcode）的單細(xì)胞識別，給每個細(xì)胞加上獨一無二的DNA序列，這樣在測序的時候就把攜帶相同barcode的序列視為來自同一個細(xì)胞了。這種策略，可以通過一次建庫，測得數(shù)百上千個單細(xì)胞的信息。其優(yōu)點是細(xì)胞通量高，單個細(xì)胞成本低，缺點是會浪費一些細(xì)胞。
目前，單細(xì)胞測序技術(shù)的流程主要包括單細(xì)胞懸液制備、單細(xì)胞分離、文庫制備、測序與數(shù)據(jù)分析。
而影響單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出和質(zhì)量的因素有很多，比如單細(xì)胞的分離效率、提取的DNA或RNA的質(zhì)量、擴增的全基因組或轉(zhuǎn)錄組的質(zhì)量、文庫的質(zhì)量等，因此測序流程中各個步驟的質(zhì)控環(huán)節(jié)必不可少。全自動的核酸片段分析儀是測序過程中質(zhì)控的主流方法，由杭州厚澤生物科技有限公司代理的Qsep系列全自動核酸片段分析儀，利用毛細(xì)管電泳的技術(shù)原理，在500bp以內(nèi)分辨率可達(dá)1%，而且靈敏度下限可以達(dá)到1pg/ul，1-100個任意數(shù)量的靈活通量，5分鐘即可上手，便捷操作，可以提供gDNA（RNA）-cDNA-文庫的一體化質(zhì)控方案，為單細(xì)胞測序保駕護(hù)航！
圖2. Qsep系列全自動核酸片段分析儀
其中，gDNA或RNA的質(zhì)量對后續(xù)文庫構(gòu)建至關(guān)重要，包括完整性、純度及濃度，Qsep系列全自動核酸片段分析儀可以提供gDNA和RNA的質(zhì)量指數(shù)評估（即DQN值和RQN值，值越高表示質(zhì)量越好），同時也有28s/18s比值及DV200，用于輔助判斷RNA質(zhì)量。
圖3. gDNA和RNA質(zhì)控（Qsep結(jié)果圖）
之后，通過體外轉(zhuǎn)錄或PCR擴增cDNA，將擴增好的cDNA用于文庫制備和高通量測序，Qsep系列全自動核酸片段分析儀可對cDNA進(jìn)行檢測，利用smear分析功能判斷樣本的片段分布，一些低濃度的彌散cDNA樣本也可以很好地檢測；制備好的文庫需要檢測片段大小及接頭殘留情況，一般情況下質(zhì)量較好的文庫是長度范圍150-700bp，接近正態(tài)分布的圓滑峰型，Qsep系列全自動核酸片段分析儀可以提供片段大小、片段分布范圍、相對定量濃度等信息，用于判斷建庫是否成功。正如杭州厚澤生物科技有限公司CEO鄭玲燕女士在單細(xì)胞技術(shù)及應(yīng)用圓桌論壇上提出：“單細(xì)胞測序行業(yè)質(zhì)檢要求高，Qsep系列全自動核酸片段分析儀是一款核酸質(zhì)檢的專業(yè)儀器，可以幫助研究人員降低研究成本，高效、高質(zhì)量完成質(zhì)檢工作”。
圖4. cDNA和文庫質(zhì)控（Qsep結(jié)果圖）
綜上所述，單細(xì)胞測序可以高通量地檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息，在細(xì)胞異質(zhì)性研究、細(xì)胞分群、新類型細(xì)胞發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞發(fā)育分化等研究中發(fā)揮強大作用，推進(jìn)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究飛速發(fā)展。
